واکنش زنجیرهای پلیمراز : اصول، مراحل و کاربرد
واکنش زنجیرهای پلیمراز یک فرآیند آنزیمی است که در آن یک ناحیه خاص از DNA بارها و بارها تکرار می شود تا کپی های زیادی از یک توالی خاص به دست آید. پرکاربردترین روش تقویت اسید نوکلئیک هدف، واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) است. این روش ترکیبی از اصول هیبریداسیون اسید نوکلئیک مکمل با تکثیر اسید نوکلئیک است که به طور مکرر در چرخه های متعدد اعمال می شود. این روش میتواند یک نسخه از یک هدف اسید نوکلئیک را که اغلب با روشهای هیبریداسیون استاندارد غیرقابل تشخیص است، تقویت کند و در یک دوره نسبتاً کوتاه به 107 نسخه یا بیشتر ضرب کند.
بنابراین، این هدف وسیعی را فراهم میکند که به آسانی با روشهای متعدد قابل شناسایی است.
اصول PCR
توالی هدف اسید نوکلئیک به رشتههای منفرد دناتوره میشود، آغازگرهای (primers) اختصاصی برای هر توالی رشته هدف اضافه میشوند و DNA پلیمراز افزودن دئوکسی نوکلئوتیدها را کاتالیز میکند تا رشتههای جدید مکمل هر یک از رشتههای دنباله هدف را گسترش داده و تولید کند (چرخه ۱). در چرخه 2، هر دو محصول دو رشته ای چرخه 1 دناتوره می شوند و متعاقبا به عنوان اهدافی برای اتصال (annealing) بیشتر آغازگر و گسترش توسط DNA پلیمراز عمل می کنند. پس از 25 تا 30 چرخه، حداقل 107 نسخه از DNA هدف ممکن است با استفاده از این چرخه حرارتی تولید شود.
الزامات PCR
- یک واکنش PCR شامل DNA دو رشتهای هدف، دو آغازگر است که به دنبالههای طرفین روی رشتههای متضاد هدف هیبرید میشوند، هر چهار تری فسفات دئوکسی ریبونوکلئوزید و یک DNA پلیمراز همراه با بافر، فاکتورهای کمکی آنزیم و آب.
- از آنجایی که واکنش به صورت دوره ای تا دمای بالا گرم می شود، PCR به استفاده از DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت بستگی دارد.
- بسیاری از آنزیم های پایدار در برابر حرارت از باکتری های گرمادوست (باکتری هایی که در محیط های با دمای بالا زندگی می کنند) اکنون به صورت تجاری در دسترس هستند.
- اولین و رایج ترین مورد استفاده، Taq polymerase از باکتری گرمادوست Thermus aquaticus است.
مراحل PCR
الف. استخراج ( Extraction ) و دناتوره کردن ( Denaturation ) DNA هدف
- برای PCR، ابتدا اسید نوکلئیک از ارگانیسم یا نمونه بالینی حاوی ارگانیسم هدف با روشهای حرارتی، شیمیایی یا آنزیمی استخراج میشود (رها میشود).
- پس از استخراج، اسید نوکلئیک هدف به مخلوط واکنش حاوی تمام اجزای لازم برای واکنش زنجیرهای پلیمراز (پرایمرها، نوکلئوتیدها، یونهای کووالانسی، بافر و آنزیم) اضافه میشود و در یک سیکلر حرارتی قرار میگیرد تا تحت تکثیر قرار گیرد.
ب. مراحل تکثیر ( Amplification )
PCR معمولی شامل 25 تا 50 چرخه تکراری است که هر چرخه شامل سه واکنش متوالی است:
- Denaturation
- Annealing
- Extension
دناتوره سازی
مخلوط واکنش تا 95 درجه سانتیگراد برای مدت زمان کوتاهی (حدود 15 تا 30 ثانیه) حرارت داده می شود تا DNA هدف به رشته های منفرد که می توانند به عنوان الگوهایی برای سنتز DNA عمل کنند.
اتصال پرایمر
مخلوط به سرعت تا دمای مشخصی خنک میشود که به دو آغازگر اجازه میدهد تا به توالیهای هر یک از دو رشته کنار DNA هدف متصل شوند.
پرایمرها توالی کوتاه و تک رشتهای از اسید نوکلئیک هستند (یعنی اولیگونوکلئوتیدها معمولاً 20 تا 30 نوکلئوتید طول دارند) که برای هیبریداسیون خاص (آنیل) با یک هدف اسید نوکلئیک خاص انتخاب میشوند و اساساً مانند پروب عمل میکنند.
این دمای اتصال با دقت محاسبه میشود تا اطمینان حاصل شود که پرایمرها فقط به توالیهای DNA مورد نظر (معمولاً در حدود 55 درجه سانتیگراد) متصل میشوند.
یک پرایمر به هر رشته متصل می شود. دو رشته والدین با یکدیگر اتصال مجدد نمی شوند زیرا پرایمرها بیش از DNA والدین زیاد هستند.
گسترش
دمای مخلوط به 72 درجه سانتیگراد (معمولا) افزایش می یابد و برای مدت زمان از پیش تنظیم شده در این دما نگهداری می شود تا DNA پلیمراز بتواند با کپی کردن الگوهای تک رشته ای، هر آغازگر را طویل کند. اتصال پرایمرها به توالیهای هدف، الگو لازم را فراهم میکند که به DNA پلیمراز اجازه میدهد نوکلئوتیدها را به انتهای 3’ (انتهای) هر آغازگر اضافه کند و توالی مکمل الگوی هدف را گسترش دهد.
Taq polymerase آنزیمی است که معمولاً برای گسترش پرایمر استفاده می شود که در دمای 72 درجه سانتیگراد رخ می دهد. این آنزیم به دلیل توانایی آن در عملکرد مؤثر در دماهای بالا و مقاومت در برابر دمای دناتوره 94 درجه سانتیگراد طی چندین چرخه استفاده می شود.
توانایی اجازه دادن به اتصال و گسترش پرایمر در دماهای بالا بدون آسیب رساندن به پلیمراز، سختی واکنش را افزایش می دهد، بنابراین شانس تقویت اسید نوکلئیک غیر هدف (یعنی تقویت غیر اختصاصی) را کاهش می دهد.
سه مرحله از چرخه PCR تکرار می شود.
با انجام چرخههای واکنش بیشتر و بیشتر، DNA دو رشتهای به تعداد بیشتری سنتز میشوند. پس از 20 چرخه، DNA اصلی یک میلیون برابر شده است و این مقدار پس از 30 چرخه به یک میلیارد برابر (1000) میلیون افزایش می یابد.
ج. تجزیه و تحلیل محصول
- ژل الکتروفورز محصول تقویت شده معمولاً پس از تقویت استفاده می شود.
- DNA تکثیر شده با انجام الکتروفورز ژل آگارز با توجه به اندازه مولکولی خود به صورت الکتروفورزی منتقل می شود.
- DNA تقویت شده نوارهای شفافی را تشکیل می دهد که می توانند تحت نور ماوراء بنفش (UV) قابل مشاهده باشند.
مزایای PCR
- PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز) یک تکنیک بسیار ساده و در عین حال بسیار قدرتمند است.
- این امکان تقویت عظیم هر توالی خاصی از DNA را فراهم می کند، مشروط بر اینکه توالی های کوتاه دو طرف آن شناخته شده باشند.
- ضمن افزایش حساسیت و حفظ ویژگی، امکان تشخیص و شناسایی سریعتر را فراهم کنید.
کاربرد PCR
PCR در حال حاضر کاربردهای بسیار گسترده ای دارد و کاربردهای جدید به طور منظم در حال ابداع است.
- PCR می تواند یک مولکول DNA را از یک مخلوط پیچیده تقویت کند و تا حد زیادی از نیاز به استفاده از شبیه سازی DNA برای آماده سازی آن مولکول جلوگیری کند. انواع این تکنیک به طور مشابه می توانند یک مولکول RNA خاص را از یک مخلوط پیچیده تقویت کنند.
- تعیین توالی DNA با استفاده از PCR بسیار ساده شده است و این کاربرد در حال حاضر رایج است.
- با استفاده از پرایمرهای مناسب، می توان از PCR برای ایجاد جهش نقطه ای، حذف و درج DNA هدف استفاده کرد که تجزیه و تحلیل بیان و عملکرد ژن را تا حد زیادی تسهیل می کند.
- PCR بسیار حساس است و می تواند مقادیر بسیار کمی از DNA را تقویت کند. بنابراین، با استفاده از پرایمرهای مناسب، میتوان مقادیر بسیار کمی از باکتریها و ویروسهای مشخص شده را در بافتها شناسایی کرد که PCR را برای تشخیص پزشکی ارزشمند میکند.
- PCR در حال حاضر برای مشخص کردن نمونههای DNA مهم از نظر پزشکی بسیار ارزشمند است. به عنوان مثال، در غربالگری بیماری های ژنتیکی انسان، به سرعت جایگزین استفاده از RFLP ها می شود.
- به دلیل حساسیت فوق العاده آن، PCR در حال حاضر اساساً برای پزشکی قانونی مهم است. حتی می توان از PCR برای تکثیر DNA یک موی انسان یا یک قطره میکروسکوپی خون باقی مانده در صحنه جنایت استفاده کرد تا بتوان مشخصات دقیق را مشخص کرد.
“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.